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Erythropoetin(EPO)
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Höhentraining. Das
Erfolgskonzept der Ausdauersportarten.
von Ulrich Fuchs, Manfred Reiß Preis: EUR 13,29 Taschenbuch - 128 Seiten Erscheinungsdatum: 1990 Hier bestellen! |
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Peptidhormon-Erythropoietin
Nachweisverfahren Eine Kontrolle von Dopingmanipulationen mit Erythropoietin (EPO), wobei eine Unterscheidung zwischen körpereigenem EPO (humanes, hEPO) und gentechnisch hergestelltem EPO (rekombinantes, rEPO) erfolgen müsste, ist bisher im Rahmen der Dopinganalytik noch nicht möglich. Es werden derzeit zwei Ansätze zum Nachweis von EPO verfolgt: direkte sowie indirekte Nachweisverfahren. Besondere Aktualität hat zur Zeit ein direktes Nachweisverfahren, dass im französischen Antidopinglabor entwickelt wurde und unter dem folgenden Punkt näher beschrieben wird. Direktes Verfahren: Zwischen humanem EPO und rekombinantem EPO, das mittels gentechnisch veränderter Ovarienzellen chinesischer Hamster hergestellt wird, bestehen geringfügige Unterschiede in den Kohlenhydratketten. Hierbei zeigt sich eine Heterogenität, die sich in einer unterschiedlichen Anzahl an negativ geladenen endkettigen Zuckergruppen (Sialinsäure) äußern können bzw. in der prozentualen Verteilung der beteiligten Zucker untereinander. Die von den Autoren Lasne und de Ceaurriz (8) beschriebene Methodik wendet eine Auftrennung nach Ladungen an, wobei eine elektrophoretische Trennung im Rahmen einer Isoelektrischen Fokusierung erfolgt. Eine anschließende Anfärbung mittels einer gegen EPO entwickelten Antikörperreak-tion ergibt ein charakteristisches Pattern im elektrischen Feld. Hierbei zeigen die bisherigen Ergebnisse, das eine Differenzierung zwischen humanem und rekombinantem EPO grundsätzlich möglich ist. Eine Arbeitsgruppe des IOC hat die bisherigen Daten der französischen Kollegen vor der Tour de France 2000 eingesehen und vorgeschlagen, dass zur endgültigen Absicherung der Methode (Validierung) noch verschiedene physiologische Einflussfaktoren (u.a. Höhenaufenthalt) auf dieses Pattern untersucht werden müßten, um falsch postive Fälle auszuschließen. Ob diese Methode dann für die Olympischen Spiele in Sydney ein-setzbar ist, bleibt abzuwarten. Zumindest für die Tour de France wurde vom Internationalen Radsportbund angekündigt, dass alle Kontrollproben während der Tour tiefgefroren werden. Es wird eine Nachanalyse aller Proben erfolgen, wenn diese direkte Bestimmungsmethode anerkannt ist. Sanktionen werden bei positiven Fällen nachträglich ausgesprochen. Eine Anwendung dieser Methode zusammen mit einem möglichen indirekten Nachweisverfahren ist weiterhin denkbar. Indirekte Verfahren: Bei der
indirekten Bestimmung werden derzeit Blutparameter
erfasst, die sich nach kurz- und langfristiger EPO-Anwendung
verändern. Hierzu zählen die Gesamtzahl an Erythrozyten,
der Hämatokritwert, die Gesamt-zahl an Hämoglobin, die
Hämoglobinkonzentration, die An-zahl an Reticulozyten,
Makrozyten, die Konzentration an Eisentransferrin-Rezeptor
(9) und die Serum-konzentration von EPO selber. Anhand
dieser Blutparameter sollen durch Verlaufskontrollen bei
Athleten individuelle Blutprofile erstellt werden, die
eine Möglichkeit zur Beurteilung einer Dopingmanipulation mit
EPO ermöglichen. Eine solche Multivariantenmethode wurde
von einer australischen Arbeitsgruppe kürzlich publiziert
.
Jahrgang 53, Nr. 1 (2002) DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR
SPORTMEDIZIN 25 Erythropoietin zählt zwar zu den vom IOC verbotenen Dopingsubstanzen, aber der Nachweis eines Missbrauchs war in den letzten Jahren trotz intensiver Forschungen nicht möglich. Zur Zeit existieren ein indirekter Nachweis, der auf einer statistischen Auswertung von Parametern der Eyrthropoese basiert, und ein direkter Nachweis, der strukturelle Unterscheide zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin nutzt. Die wesentlichen, aktuellen Probleme betreffen die praktische Durchführung der Dopingkontrollen. DasGlykoproteinhormon Erythropoietin (EPO) ist zweifellos eines der spektakulärsten Dopingmittel, weil ihm vielfach ein nahezu ubiquitärer Missbrauch vor allem in Ausdauerdisziplinen mit dem Ziel einer erhöhten Sauerstofftransportkapazität unterstellt wird. Die mangelnde Nachweisbarkeit stellt die gesamte Dopingkontrolle in Frage. Richtig ist, dass EPO als Peptidhormon bisher tatsächlich eine Schwachstelle der Dopinganalytik darstellte. Andererseits bleibt die Behauptung verbreiteten Missbrauchs weitgehend Vermutung, wenn man von einzelnen zugegebenen Fällen und Sicherstellungen von Präparaten zur offensichtlich missbräuchlichen Verwendung im Sport absieht. Mit den neuesten Veröffentlichungen (3, 5) besteht die Möglichkeit eines schnellen Probenscreenings wie auch einer sicheren Bestätigung des Ergebnisses. Indirekte Methode - Blutbild und Serumparameter - Screening Löslicher Transferrinrezeptor Retikulozyten Kombination indirekter Parameter Ein Parameter allein und auch die einfache Kombination mehrer Grenzwerte ist zur sicheren Erfassung eines EPO-Dopings nicht ausreichend. Daher war ein statistisch gesichertes Modell notwendig, welches den Missbrauch von rekombinantem EPO sicher nachweist. Dieses Modell wurde vom Australian Institute of Sport entwickelt (5). Aus der Datenanalyse ergaben sich die relevanten Parameter Retikulozythämatokrit, Erythropoietin, löslicher Transferrinrezeptor, Hämatokrit und Prozentanteil Makrozyten. Für die Erfassung eines akuten Missbrauchs mit dem sogenannten „ON"-Modell sind alle oben aufgeführten Parameter im Modell integriert. In der Abklingphase wurde ein anderes, das sogenannte "OFF"-Modell, angewandt, das nach einem Missbrauch von Epo den Athleten überführen soll. In diesem Modell sind Retikulozythämatokrit, Erythropoietin und Hämatokrit die entscheidenden Parameter. Notwendig für die Anwendung der beiden Modelle ist jedoch die Messung der Vollblutproben mit einem vollautomatischen Hämatologiesystem (H*3 oder ADVIA 120; Bayer Diagnostics). Nur bei diesen Automaten erfolgt eine Bestimmung der einzelnen Zellen und ermöglicht somit die Berechnung des Retikulozythämatokrit, der für die Anwendung beider statistischen Modelle notwendig ist. Direkte Methode - Isoelektrische Fokusierung (IEF) - Bestätigung Aufgrund der vereinzelten falsch-positiven Ergebnisse, der
fehlenden Möglichkeit einer B-Probe wegen der geringen zeitlichen Stabilität der
Vollblutprobe und des fehlenden, gerichtsfesten Beweises der Applikation von
exogenem EPO ist die Sanktionierung nur auf der Basis der statistischen Modelle
der indirekten Parameter noch unsicher. Für den Beweis eines Dopings mit EPO
wäre daher die Trennung zwischen rekombinantem und körpereigenem EPO notwendig.
Die Methode von Wide et al. (6) ermöglichte zwar eine Trennung, konnte
aber in keinem Labor reproduziert werden, zudem war sie extrem teuer und
aufwendig und daher für den Einsatz in der Routine nicht geeignet. Für großes
Aufsehen sorgte daher die Veröffentlichung des französischen Dopinglabors (3),
wonach mittels isoelektrischer Fokussierung eine Auftrennung der verschiedenen
Isoformen des rekombinanten und des humanen EPO im Urin gelang. Bei mit EPO
behandelten Patienten konnte das Bandenmuster des rekombinanten EPO
wiedergefunden werden. Nachteil der Methode ist der noch große Zeitaufwand (für
zehn Proben drei Tage) verbunden mit hohen Kosten. Zu den Olympischen Spielen
2000 in Sydney wurde sowohl die indirekte Methode (5) zum Screening als auch die
direkte Analysenmethode (3) eingesetzt. Der große Vorteil der praktischen
Einführung der Kontrollen war die hohe Anzahl Athleten in einem engen Umkreis,
so dass die Vollblut- und Serumproben wie auch die Urinproben schnellstens in
das analysierende Labor gelangten. Die zur Zeit weltweit bevorzugte
Verfahrensweise besteht in der Analyse von Blut und Serum und der Anwendung der
oben aufgeführten statistischen Modelle "ON" und „OFF". Erst wenn durch eines
der beiden Modelle eine Probe auffällig wird, erfolgt die Analyse der Urinprobe.
Eine relativ große Anzahl an Proben kann somit schnell gescreent werden und die
teuere und aufwendige Prozedur des direkten Nachweises muss nur bei den wenigen
auffälligen Proben angewandt werden. Die B-Probe eines positiven (auffälligen)
Athleten könnte dann auch in einem anderen Labor und vor allem zu einem späteren
Zeitpunkt untersucht werden. Für die Probennahme stellen sich gegenwärtig noch
mehrere, praktische Probleme. Bisher existiert noch keine allgemein gültige
Regelung zur Entnahme von Blut für die Erfassung eines EPO-Dopings. Die
Probennahme von Blut und Serum erfordert neben der Schulung des Personals (Ärzte
oder Schwestern) einen wesentlich größeren Zeitaufwand als eine vergleichbare
Urinprobe, da neben der Abnahme auch noch die Serumgewinnung durchgeführt werden
muss. Auch an Probenlagerung und Transport werden größere Anforderungen
gestellt: neben der Kühlung der Vollblutproben bei 4°C müssen die Serum- und
auch vorzugsweise die Urinproben mittels Trockeneis tiefgefroren werden. Während
die Serum- und Urinproben gefroren länger transportiert werden können, müssen
die gekühlten Blutproben unverzüglich zum Labor gelangen und sofort gemessen
werden. Für eine effektive Kontrollwirkung empfiehlt es sich, Probenabnahmen
nicht nur bei Wettkämpfen, sondern analog den normalen Trainingskontrollen auch
unangekündigt durchzuführen. 1. Brugnara C, Colella G, Cremins J, Langley RC, Schneider TJ,
Rutherford CJ, Goldberg MA: Effects of subcutaneous recombinant human
erythropoietin in normal subjects: Development of decreased retikulocyte
hemoglobincontent and iron-deficient erythropoiesis. J Lab Clin Med 123 (1994)
660-667. Korrespondenzadresse Blutpaß zur DopingkontrolleFLORENZ (mp). Ein Mittel im Kampf gegen Doping könnte der Blutpaß werden, der jetzt bei einem Treffen des Europäischen Verbandes der Hämatologen in Florenz vorgestellt worden ist. Der Paß zeigt Blutparameter an, die sich auch bei Anstrengungen kaum ändern - sehr wohl aber bei der Zufuhr von Erythropoetin. Finanziert werden soll das Projekt von der Anti-Doping-Weltagentur. Ärzte Zeitung, 12.06.2002 Die Geschichte des EPO-Dopings in der Presse in News und Meldungen: http://www.dopingnews.de/EPO-Doping-Berichte-News.htm Was ist Erythropoetin? Deutsche Doping-Kontrolleure ziehen eine erfreuliche Bilanz Urintest reicht als Nachweis von EPO-Doping Neue Methode zum
Nachweis von EPO
entwickelt Aufregung über Doping-Betrug: Lässt Fleckenreiniger
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Doping im Spitzensport (2000) Hormon Report.
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Die Halbwertszeit von Darbepoetin (NESP)
liegt bei ca. 21 h nach intravenöser Injektion
Nach subkutaner Injektion (Injektion ins Hautgewebe) verlängert sich die
Halbwertszeit von NESP auf ca. 49 h (27-89h)
Erythropoietin eine Halbwertszeit von 8,5 h aufweist.
Subcutan 16-24 h für Epoetin.
http://www.dshs-koeln.de/biochemie/rubriken/00_home/00_dar.html
Doping: neues Analyseverfahren für
biotechnologisch hergestelltes EPO
Eines der gebräuchlichsten Dopingmittel ist das schwer nachweisbare
Erythropoetin. In Zeiten, in denen es immer mehr "Kopien" von
biotechnologisch hergestellten Arzneistoffen (Biosimilars) gibt, wird es
auch schwieriger den Unterschied zwischen körpereigenem und biosynthetisch
erzeugtem EPO nachzuweisen. ChemikerInnen der Technischen Universität (TU)
Wien erarbeiten mit dem ARC Seibersdorf, basierend auf
MALDI-Massenspektrometrie, ein neues Analysenverfahren, um den Dopingsündern
auf die Spur zu kommen.
"Mit der MALDI-Massenspektrometrie, ein Verfahren, das zur zerstörungsfreien
Desorption/Ionisierung von großen Molekülen, insbesondere Biopolymeren
eingesetzt wird, vergleichen wir die täuschend ähnliche, "humanisierte" Form
von EPO mit der körpereigenen Substanz. Die zwei Proben unterscheiden sich
entweder im Aufbau der Aminosäureketten und/oder der dazugehörigen
Zuckerketten. Je nachdem welche Struktur diese Zuckerketten haben und an
welcher Stelle sie gebunden sind, erkennen wir ob es sich um natürliches
oder biosynthetisches EPO handelt", erläutert Professor Günter Allmaier vom
Institut für Chemische Technologien und Analytik der TU Wien.
Bisherige Methoden, wie beispielsweise die isoelektrische Fokussierung,
weisen mehrere Schwächen auf. Zunächst benötigt man bis zum Erhalt des
Testergebnisses zwischen zwei und drei Tage. Die Methode gilt darüber hinaus
als schwer automatisierbar und basiert auf Antikörpern, die EPO im Urin zwar
nachweisen können, aber mitunter zu wenig spezifisch sind und die Struktur
nicht genau genug detektieren.
Allmaier und seine MitarbeiterInnen konzentrieren sich nun auf die Suche
nach geeigneten Analysenstrategien, die rekombinantes EPO direkt im Urin
nachweisen können. Eine "Lab-on-Chip-Technologie" soll mit der
laserbasierenden Flugzeitmassenspektrometrie verbunden werden. Nach
anschließender Testphase rechnet Allmaier, dass das Verfahren etwa 2009 zur
Patentreife gelangen könnte und eine wertvolle Unterstützung im
Anti-Dopingkampf liefern würde. Allmaier: "Der wesentlichste Punkt an
unserer Strategie ist, dass wir ein Verfahren entwickeln, mit dem das
EPO-Molekül selbst nachgewiesen wird. Alle anderen Vorgehensweisen waren
bisher indirekt."
EPO-Präparate erhöhen die Produktion von roten Blutkörperchen, die
ihrerseits wiederum mehr Sauerstoff im Blut transportieren. Der Organismus
wird dadurch leistungsfähiger. Aus diesem Grund wurde EPO bereits seit Ende
der 80iger Jahre als Dopingmittel vor allem in Ausdauersportarten wie dem
Radsport missbraucht. Für die innovativste Publikation im Zeitraum 2005 bis
2006 in der Zeitschrift "Rapid Communications in Mass Spectrometry" erhielt
Günter Allmaier jüngst auch den John Beynon Prize Award 2007. Diese Arbeit
war zugleich der Startpunkt einer intensiven Kooperation mit Dr. Reichel vom
Dopingkontrolllabor des ARC Seibersdorf.
Univ.Prof. Mag.pharm. Dr. Günter Allmaier
Technische Universität Wien
Institut für Chemische Technologien und Analytik
Quelle: Technische Universität Wien 26.10.2007 Infos für Ärzte
